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Pourquoi utiliser les anticorps CLDN18 pour détecter la CLDN18.2 dans les échantillons de tumeurs CG/JOG ?
Les anticorps CLDN18 peuvent identifier les deux isoformes de CLDN18 - CLDN18.1 et CLDN18.2. Mais lors de l’évaluation du tissu tumoral CG/JOG, la coloration peut être attribuée à la présence de la CLDN18.2 car2,3 :
- La CLDN18.1 est principalement exprimée dans les adénocarcinomes du tissu pulmonaire et son expression est négligeable ou absente dans les cancers CG/JOG3
- La CLDN18.2 est normalement présente dans l’épithélium gastrique et est souvent sur-exprimée dans les tissus gastriques tumoraux3
Préparation des échantillons et analyses préalables
Une manipulation et une préparation appropriées des échantillons sont essentielles pour garantir la fiabilité des résultats sur le biomarqueur.1
Comment préparer les échantillons de la CLDN18.2 pour l’analyse
Takeshi Kuwata, MD, PhD
Préparation de l’échantillon
Les recommandations préconisent un entretien quotidien du processeur de tissus conformément aux recommandations du fabricant et un maintien rigoureux de la qualité des fluides du processeur, y compris le pH et la pureté du formol et la contamination de l’eau par les alcools.1
Temps d’ischémie froide
Selon les recommandations actuelles, le temps d’ischémie froide doit être limité à ≤ 60 minutes.1
Fixation
Les recommandations fournissent des préconisations concernant les dimensions et la durée de la fixation de l’échantillon.1
Dimensions clés1
L’épaisseur de l’échantillon ne doit pas dépasser 4-5 mm
Le tissu doit être complètement immergé dans le fixateur
Le ratio entre le volume du fixateur et la masse du tissu ne doit pas être inférieur à 4:1, avec un ratio optimal de 10:1
La paraffine doit être fondue à une température < 60°C
Durées clés1
Pour la stabilisation, le tissu doit être fixé dans du formol neutre tamponné au phosphate à 10 % (pH 7,0) pendant au moins 6 heures et pas plus de 24 à 36 heures.
Si le tissu a une teneur élevée en graisse, la fixation peut nécessiter jusqu’à 48 heures.
Fixation insuêsante des tissus1
Il est important d’optimiser les variables pré-analytiques afin de minimiser les artefacts de coloration.
Rougissement cytoplasmique dû à une fixation insuffisante qui peut interférer avec la précision de l’évaluation du score membranaire.
Préparation des échantillons2
Les échantillons de tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE)*, traités en routine, peuvent être utilisés pour les tests IHC
Les échantillons tels que les ponctions à l’aiguille fine (PAF), les échantillons de cytologie ou de lésions osseuses métastatiques ne se prêtent pas à la coloration de la CLDN18.
Les sections de tissus peuvent être coupées à 3-6 μm**
Avant la coloration, les lames doivent être complètement séchées soit à température ambiante (séchage à l’air) soit par une cuisson hors ligne (au four) à 60°C pendant 60 minutes**
*FFPE : Formalin-fìxed, paraffin-embedded
**Spécifique à CLDN18
Conditions de stockage1
Afin d’assurer l’intégrité des échantillons, les espaces de stockage doivent être :
Secs
Exempte de contaminants
A température ambiante (18 à 25°C)
Analyse
Options pour l’évaluation de l’expression de la CLDN18.2 en IHC
Un certain nombre de tests, d’anticorps et de plateformes sont disponibles pour l’évaluation de l’expression de la CLDN18.2 :
- le test IVD VENTANA CLDN18 (43-14A),
- l’anticorps LSBio PathPLus CLDN18 et l’anticorps recombinant Abcam anti-Claudine 18 (43-14A).
Les options pour les plateformes comprennent BenchMark ULTRA, Dako Autostainer, et Leica Bond.4
La liste des tests/anticorps et des plateformes n’est pas exhaustive.
Test IVD VENTANA
CLDN18 (43-14A)
Anticorps LSBio
PathPLusTM CLDN1
Anticorps recombinant Abcam anti-Claudine 18 (43-14A)
Comment procéder au test CLDN18.2 ?
Christoph Röcken, MD
Choisir les contrôles appropriés
Il est essentiel de disposer de contrôles appropriés pour la détection de la CLDN18.2 dans les échantillons de tumeurs CG/JOG. Voici quelques points clés concernant leur sélection et leur utilisation.2,5
Contrôles de validation
Les recommandations préconisent que les laboratoires valident et/ou vérifient les tests immunohistochimiques avant de les mettre en service clinique et qu’ils incluent des tissus positifs, négatifs et périphériques, reflétant l’utilisation prévue du test.5
Des contrôles de tissus sont disponibles dans le commerce auprès de différents fournisseurs.
Contrôles utilisés pour les tests
- II est recommandé d’utiliser des contrôles positifset des négatifs2
- Le tissu de métaplasie intestinale gastrique est un exemple de contrôle positif et négatif approprié, car il présente2 :
- une forte coloration membranaire dans les cellules épithéliales gastriques normales
- une coloration membranaire faible à modérée des cellules épithéliales dans les zones de métaplasie
- une absence de coloration dans la lamina propria, les lymphocytes, les muscles lisses, les vaisseaux sanguins et les nerfs périphériques
- Si les témoins positifs ne présentent pas de coloration positive, les résultats obtenus pour l’échantillon testé doivent être considérés comme non valides2
- Les témoins tissulaires positifs connus ne doivent être utilisés que pour contrôler les performances des réactifs et des instruments, et non comme aide à la détermination du diagnostic spécifique des échantillons testés2
CAP PPMPT, College of American Pathologists Preanalytics for Precision Medicine Project Team ; CLDN, claudine ; CLDN18.1, isoforme 1 de la claudine ; CLDN18.2, isoforme 2 de la claudine ; FDA, US Food and Drug Administration ; G/ GEJ, gastric/ gastroesophageal junction ; IVD, in vitro diagnostic.
Indicateurs de performance des plates-formes et des anticorps
Dans une étude évaluant la reproductibilité et la comparabilité de trois anticorps CLDN18 et de plateformes de coloration IHC dans une cohorte de 27 laboratoires internationaux4,*,† :
- La performance analytique (exactitude, sensibilité et spécificité) du test DIV VENTANA CLDN18 (43-14A) était > 95 % et reproductible dans les 27 laboratoires par rapport aux résultats de référence consensuels4
- La performance analytique était équivalente à celle de l’essai DIV VENTANA (43-14A) pour l’anticorps LSBio lorsqu’il était coloré sur la plateforme Dako ou Leicap4
- La coloration était reproductible pour l’anticorps LSBio4
*Les anticorps utilisés dans l’étude comprenaient l’essai IVD VENTANA CLDN18 (43-14A) de Roche Tissue Diagnostics, l’anticorps PathPlus™ CLDN18 de LSBio et l’anticorps Claudin-18 de Novus Biologicals. Les plateformes comprenaient BenchMark ULTRA, Dako Autostainer et Leica Bond.4
†Les scores de référence consensuels de tous les anticorps pour chaque échantillon ont été déterminés par examen central. La positivité de CLDN18.2 a été défìnie par un seuil de ≥75 % de cellules tumorales exprimant CLDN18 membranaire avec une intensité de coloration modérée à forte (≥2+). Par conséquent, les anatomopathologistes participants devaient soumettre un avis binaire positif/négatif ainsi qu’une estimation du pourcentage de cellules colorées. Les scores IHC soumis par les laboratoires ont été comparés au score consensuel de référence et considérés comme discordants si le résultat binaire positif/négatif différait. Une analyse statistique a été réalisée pour la comparaison et un critère d’acceptation de 85 % (≥0,85) a été appliqué.4
Le testing reflex permet d’améliorer les résultats cliniques des patients
Les recommandations préconisent de tester tous les biomarqueurs possibles, tels que HER2, au moment du diagnostic si un cancer gastrique métastatique est suspecté ou documenté.6
Les recommandations de l’ESMO préconisent le test CLDN18.2.6
Tout nouveau biomarqueur doit être testé parallèlement aux autres biomarqueurs pour permettre une communication des résultats en temps utile.6,7
Le testing reflex permet de démarrer une thérapie ciblée appropriée précocement
Dans une cohorte de patients atteints de cancer au stade avancé comprenant divers types de cancer (N = 1 423), la mise en place d’un protocole de testing reflex au moment du diagnostic a été associé à une amélioration de la survie globale.7
Survie globale à 12 mois
Nous avons eu la preuve que le testing reíex améliorait les résultats cliniques du patient. Il est essentiel que les pathologistes plaident en faveur des tests de tous les biomarqueurs prévalents et actionnables
Matteo Fassan, MD, PhD
Références: 1. Compton CC, Robb JA, Anderson MW, et al. Preanalytics and precision pathology: pathology practices to ensure molecular integrity of cancer patient biospecimens for precision medicine. Arch Pathol Lab Med 2019;143(11):1346-63. 2. Ventana CLDN18 (43-14A) assay [package insert]. Mannheim, Germany: Roche Diagnostics GmbH. 3. Sahin U, Koslowski M, Dhaene K, et al. Claudin-18 splice variant 2 is a pan-cancer target suitable for therapeutic antibody development. Clin Cancer Res 2008;14(23):7624-34. 4. Jasani B, Schildhaus HU, Taniere P, et al. Global ring study determining reproducibility and comparability of CLDN18 testing assays in gastric cancer. Poster presented at: ESMO Targeted Anticancer Therapies Congress; March 6-8, 2023; Paris, France. 5. College of American Pathologists. IHC assays—New evidence-based guideline for analytic validation (04-01-2004). https://documents.cap.org/documents/ihc-validation-webinar-handout.pdf. Accessed 03-30-2023. 6. ESMO Gastric Cancer Living Guidelines (07-2023). https://www.esmo.org/living-guidelines/esmo-gastric-cancer-living-guideline/diagnosis-pathology-and-molecular-biology/article/diagnosis-pathology-and-molecular-biology. Accessed 09-07-2023. 7. Piening B, Bapat B, Weerasinghe RK, et al. Improved outcomes from reíex comprehensive genomic proìling-guided precision therapeutic selection across a major US healthcare system [Abstract 6622]. J Clin Oncol 2023;41(Suppl 16).